德國Minerva Biolabs公司生產(chǎn)的Mynox®是一種支原體去除劑，用于消除細(xì)胞、病毒培養(yǎng)物、以及其他生物制劑中的支原體。支原體消除只需6 - 8天(加上4代DNA沖洗)。處理后，Mynox®很容易通過介質(zhì)更換去除。

Mynox®是一種無抗生素的生物試劑，可以整合到支原體膜中，損害其完整性。它的活性基于生物物理機(jī)制，因此不會產(chǎn)生耐藥菌株。其結(jié)果是滲透性內(nèi)流導(dǎo)致支原體膜解體。被清除支原體，細(xì)胞可以立即恢復(fù)其原有的形態(tài)和正常增殖速度。迄今為止，Mynox®尚未顯示會導(dǎo)致正常細(xì)胞特性的任何變化。

一、貼壁細(xì)胞的處理方法

1、制備細(xì)胞和『治療液』

在無菌的6厘米培養(yǎng)皿中加入2.8 ml含5% (v/v) FCS的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)基。加入200µl Mynox®(1瓶)。

加入2ml新鮮胰蛋白酶化的10^4 - 10^5個(gè)細(xì)胞。

包括細(xì)胞在內(nèi)的處理混合物的總體積為5ml。

2、Mynox®的處理和去除

在正常生長條件下，將細(xì)胞與『治療液』混合物保持一整個(gè)傳代過程(約6至8天)。然后除去含有Mynox®的培養(yǎng)基，將細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中傳代。8天為上限，若細(xì)胞未長滿皿底，終止處理，丟棄含有Mynox®的培養(yǎng)基，并添加新鮮的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)基。

二、懸浮細(xì)胞系的處理

1、制備細(xì)胞和『治療液』

使用無菌離心管配制『治療液』。加入1.6 ml 0.125%胰蛋白酶和5 mM EDTA。加入200µl Mynox®(1瓶)。將1.6 ml含有10% (v/v) FCS和10^4 - 10^5細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)基，從懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)移到『治療液』混合物中，進(jìn)行渦旋。包括細(xì)胞在內(nèi)的處理混合物的總體積為3.4 ml。

2、Mynox®的處理和去除

37℃孵育30分鐘。將細(xì)胞輕離心(600 × g) 5分鐘，丟棄上清。將細(xì)胞重懸于不含Mynox®的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)瓶中。

三、非包膜病毒的處理

冷凍或新鮮等量的細(xì)胞和無細(xì)胞碎片的病毒懸浮液可以處理。病毒滴度不影響治療的成功。

1、制備細(xì)胞和『治療液』

使用1.5 ml帶安全鎖的無菌反應(yīng)管配制消毒液。加入1 ml不含F(xiàn)CS的細(xì)胞培養(yǎng)基。加入100µl Mynox®。

將含有8% (v/v) FCS的125µl病毒原液轉(zhuǎn)移到混合物中。漩渦。包括病毒原液的處理混合物的總體積為1.225 ml。

2、Mynox®的處理和去除

在室溫下將消去液孵育2小時(shí)。將處理混合物在培養(yǎng)基中稀釋1:10，停止反應(yīng)。

四、包膜病毒的處理

包膜病毒外脂膜的組成與Mynox®的靶標(biāo)支原體膜相當(dāng)。這些病毒也容易受到Mynox®滅活的影響，具體取決于所使用的處理時(shí)間和濃度。為了獲得無支原體的病毒懸浮液，并具有可接受的繼代培養(yǎng)水平，初始病毒滴度應(yīng)高于10^6 TCID50。

冷凍或新鮮等量的細(xì)胞和無細(xì)胞碎片的病毒懸浮液可以處理。

1、制備細(xì)胞和『治療液』

使用無菌15ml螺旋蓋反應(yīng)管配制消去液。加入4.4 ml不含F(xiàn)CS的細(xì)胞培養(yǎng)基。加入100µl Mynox®。將0.5 ml含有8% (v/v) FCS的病毒原液轉(zhuǎn)入混合物中。漩渦。包括病毒原液的處理混合物的總體積為5ml。

2、處理和Mynox®去除

在室溫下將消去液孵育30分鐘。將處理混合物在培養(yǎng)基中稀釋1:10，停止反應(yīng)。

五、支原體檢測

經(jīng)Mynox®處理的細(xì)胞培養(yǎng)物和病毒庫應(yīng)在不使用抗支原體抗生素的情況下再培養(yǎng)四代，然后檢測支原體是否存在以驗(yàn)證培養(yǎng)純度。

對于高靈敏度的支原體污染檢測，我們推薦使用基于pcr的Venor®GeM支原體檢測試劑盒